ژن درمانی ، درمان دردهای بی درمان
نقطه ایی که یک فواره از حرکت بایستد ،سقوط می کند
سلام دوستان
به این آزمایشگاه مجازی یه سری بزنید و درون سلول گردش کنید و علاوه بر اون آزمایشات تخصصی خودتون رو بطور مجازی انجام بدین .
برای یادگیری خیلی جالبه . یشنهاد میکنم که از دست ندین .
چشمههاي خروشان تو را ميشناسند
موجهاي پريشان تو را ميشناسند
پرسش تشنگي را تو آبي، جوابي
ريگهاي بيابان تو را ميشناسند
نام تو رخصت رويش است و طراوت
زين سبب برگ و باران تو را ميشناسند
از نشابور بر موجي از «لا» گذشتي
اي كه امواج طوفان تو را ميشناسند
اينك اي خوب، فصل غريبي سر آمد
چون تمام غريبان تو را ميشناسند
كاش من هم عبور تو را ديده بودم
كوچههاي خراسان، تو را ميشناسند
میلاد مسعود امام هشتم امام رضا (ع) بر همگی دوستان مبارک باد
بعد از یه تاخیر طولانی به دلایل متعدد تصمیم گرفتم امروز با یه پروتکل کامل در مورد PCR جبران کنم . راستش بدجور گیر این PCR افتادم که انگار با من شوخیش گرفته و امروز جواب میده ولی فردا جواب نمیده و خلاصه ما رو سر کار گذاشته حسابی!!!!!!! ( کم خودمون سر کار نیستیم!)
بهر حال اگه دوستی اینجا به PCR تسلط داره خوشحال میشم که به من بگه تا در مورد گیر کارم ازش مشورت بگیرم .
و اما این پروتکل کامل که در هیچ جای نت پیدا نمیشه رو در پائین میذارم امیدوارم براتون سودمند باشه.
التماس دعا
مراحل PCR به طور خلاصه
1- denaturation حرارت دادن براي جداسازشدن دو رشته DNA در يك دقيقه
2- anealing يا چسبيدن آغاز گر ( اتصال پرايمر به هدف 9 دماي 40ـ 60 كه در اين مرحله مقدار دما بستگي به تواليهاي بازي پرايمر هاي مكمل توالي رشته DNA دارد آغاز گر ها ، در دمايي كه مانع اتصال غير اختصاص آنها مي شود . مساوي 50% باشد اين دما 55 و اگر بيشتر باشد درجه حرارت اتصال برابر 60 است . زيرا c و g داراي 3 پيوند هستند .
3- polymerization گسترش رشته DNA : در اين مرحله DNA پليمراز شروع به همانند سازي مي كند . و طويل شدن رشته مكمل ازOH اغازگر شروع مي شود . در اين واكنش از DNA پليمراز مخصوص كه در برابر حرارت مقاوم است به نام tag DNA polimerase استفاده مي گردد . اين انزيم در دماي 94 كاملا پايدار است ودماي اپيتم عمل آن 72 c است .
4- تكرار اين مراحل تا چند سيكل كه در نتيجه مقدار قابل توجهي DNA سنتز شود . تكثير DNA پس از چسبيدن اغازگر به انتهاي 5 توالي هاي مشخص از DNA الگو صورت مي گيرد تكرار مراحل باز شدن دو رشته dna با چسبيدن اغازگر و طريل شدن ان را يك سيكل پي سي ار مي نامند .
5- پس از يك سيكل pcr از يك مولكول DNA دو مولكول و پس از سيكل دوم چهار مولكول و پس از 20 مولكول DNA وجوددارد اين عمل را مي توان با استفاده از دستگاه اتوماتيك ترمال سايكلر كه قابل برنامه ريزي است به اساني انجام مي گردد .
6- تعداد چرخه ها يا سيكلها بستگي به كيفيت واكنش و مقدار DNA الگو در واكنش دارد ولي عموما بين 25ـ35 و معمولا 30 است با افزايش تعداد سيكلها باندهاي ناخواسته افزايش مي يابد .
مواد لازم PCR
1- بافر PCR: شرايط يوني PH مناسب را براي واكنش PCR فراهم مي كند
نكته : بافر به صورت x10 ساخته مي گردد . اين بافر شامل موادي با غلظت هاي زير مي باشد . داراي گليسيرول براي سنگيني كار و داراي رنگ براي مشهود سازي DNAدارد .
2- دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات
كه به صورت مخلوطي از چهار باز A-T-C-G در بازار وجوددارد تا كنار هم چيده شوند . و رشته مكمل را ايجاد كنند .
3- اغازگرها primer : پرايمرها قطعات سنتز شده اي از بازهاي آلي اند كه بر اساس قطعه اي مورد نظر الگوهاي هدف ساخته مي شوند . كه معمولا با طول 15ـ30 نوكلئوتيدهستند كه به DNA الگو متصل مي شوند و داراي انتهاي 3oh آزاد هستند .
طول پرايمرها بسيار مهم است هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند براي تعيين طول مناسب مي توان از رابطه ( تعداد بازها در ژنوم هدف 4.4.4.....>x2 ) استفاده كرد . كه n برابر تعداد بازهاي مناسب براي اغازگر مي باشد .
اين دو پرايمر دو عمل انجام مي دهند . اول اين كه محل ژني كه بايد تكثير شود را مشخص مي نمايند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند .
بايد توجه داشت دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند پرايمر مورد نظر توسط كامپيوتر انتخاب مي گردد .
4- tag DNA polymerase: يك انزيم مقاوم به دما است كه همانند سازي DNA را انجام مي دهد اين انزيم از باكترtremmus aquaticus بدست آمده است جهت سنتز DNAهميشه از 3ـ 5 مي باشد و همه انزيمها براي شروع فعاليت سنتز DNA را انجام مي دهد . كه توسط قطعات كوتاه آغازگر ها تامين مي گردد. در واقع اين انزيم غلط گيري مي كند . تا قبل از كشف آنزيم tag از انزيمw kleno استفاده مي شد . آنزيم tag پليمراز باعث شد به راحتي واكنش PCR به ورت اتوماتيك انجام شود . و با افزودن يكبار انزيم افزايش حساسيت و دقت PCR است .
5) آب براي نهايي كردن O2H.Dكه بايد كل ان حجم 50ml يا 25ml باشد .
6ـ mgcl2 كلريد منيزيم نقش كوفاكتوري در فعاليت آنزيم tag دارد .
اثر متقابل رشته dna الگو و آغازگر را افزايش مي دهد . غلظت كلريدمنيزيم اثر زيادي برروي اختصاصي شدن و نهايتا بازده واكنش PCRدارد .
غلظت زياد ان اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنرزيم تك دي ان آپلي مراز دارد و مقدار محصول نهايي را كاهش مي دهد رابطه مستقيمي بين افزايش غلظت dntps و mgcl در محلول واكنش وجوددارد و مقدار مناسب ان بايد به طور عملي در آزمايشگاه بدست آيد .
7ـ دي ان آ الگو tempate DNA :
بستر به هدف ازمايش از منابع موردنياز با استفاده از يكي از روشهاي مرسوم استخراج مي شود . معمولا به ازاي هر واكنش 5% واحد يا 1% ميكرو ليتر استفاده مي شود .
8ـ لوله هاي واكنش : لوله هاي كوچك 5% ميلي ليتر
9- سمپلريا ميكرو پيست و سر سمپلرهاي يكبار مصرف مخصوص انها كهراي برداشتن مقادير بسيار كم استفاده مي گردد .
10- دستگاه چرخش حرارتي
11- ميكرو فيوژ
12- روغن معدني mineraloil : يك قطره روي مخلوط واكنش اضافه مي شود تا از تبخير نمونه در دستگاه چرخش حرارتي thermal cycler جلوگيري مي شود . معمولا 50 ـ 60 ميكروليتر به حلول واكنش 100 ميكروليتري اضافه مي شود .
ضمنا بايد توجه داشت كه مواد قابل اتوكلاو استريل شوند . البته dntp پرايمرهاو آنزيم tag را نمي توان اتو كلاو كرد .
بازدارنده ها و افزاينده هاي فعاليت PCR:
1- مواد موجود در نمونه هاي متفاوت موجودات زنده مانند وجود تركيبات فنلي و غيره كه بايد با انتخاب صحيح روش استخراج از محلول DNA جداشود .
2- شوينده هاي موجود در بافر استخراج : در مراحل استخراج DNA از شوينده هاي غير يوني مانند tritonx و twen و… استفاده مي شود . كه برروي PCR اثر باز دارندگي ندارند ولي شوينده هاي يوني مثل sds (سديم دودسيل سولفات ) فقط به مقدار كم در محلول قابل تحمل مي باشد . بنابراين با استفاده از فنل و يا شستشو با الكل بايد اين مواد را از DNA جداكرد . مقدار 1% از ان براي پي سي ار عامل بازدارنده محسوب مي شود .
3- آنزيم پروتئيناز k كه در مراحل استخراج DNA همراه با مواد شوينده براي هضم پوتئين استفاده مي شود . به عنوان بازدارنده فعاليت PCR مي باشد . زيرا انزيم tag نسبت به انزيم حساس مي باشد . و اين انزيم cDk بايد حذف يا غير فعال شود . با تيمار گرمايي مي توان سبب غير فعال شدن اين انزيم شد كه در اين صورت بايستي بعد از تلخيص DNAبافنل و كلروفوم ان را هم سانتريوفوژ نمود كه در اين صورت باقيمانده پروتئيناز k به داخل فاز فنلي وارد شده و DNA در فاز مايع باقي مي ماند .
4- باقيمانده فنلي : فنل نيز بايستي از محيط خارج شود زيرا بازدارندگي بر فعاليت انزيم tag DNA polymerase دارد . كه به اين منظور پس از استفاده از فنل و كلروفرم از ايزو پروپانول استفاده كرد .
افزاينده هاي فعاليت PCR:
ماده غلظت
فورماميد 5%
دي متيل سولفوكسيد كمتر از 10%
تترامتيل امونيوم كلرايد 100 – 10 %
پلياتيلن گليكول 6000 5% ـ 15
گليسرول 10%- 15
توين20 5/2 – 1/0 %
پروتكل PCRمعمولي
|
مقدار حجمي (ميكروليتر) |
غلظت نهايي |
ماده |
|
5/2 1 0.5 1 1 1/0 3 متغير |
x1 2M m 200Mm 2/0ـ1 Mm 2/0ـ1 Mm 5/0u 0.5-1Mg ـ |
بافر10m 50mMMgcl2 10mndntp اغازگر1 آغازگر 2 پليمرازDNA tag DNAالگو آب مقطر استريل |
حجم نهايي واكنش PCR كه انجام خواهيد داد 25 Ml باشد تمام اجزاء فوق بجز DNA الگو ابتدا دريك لوله mix به تعداد لوله هاي تهيه و سپس بين لوله ها تقسيم مي شود . و پس يك لوله شاهد مثبت و يك لوله شاهد منفي نيز بايد داشته باشد لوله شاهد مثبت حاوي DNA الگويي است كه قبلا كارايي ان در واكنش pcr تاييد شده است لوله شاهد منفي بدون الگو مي باشد بعد از اضافه كردن تمام محلولهاي يك قطره روغن معدني براي جلوگيري از تبخير به ان اضافه نموده و پس لوله ها را در دستگاه چرخانند قرار دهيد .
درجه حرارت وزمان مناسب براي دستگاه :
سيكل اول :
1- سه دقيقه 92ـ94 واسرشت كردن
2- 50 ثانيه 50 –60 اتصال آغازگرها
3- 1 دقيقهC 72 DNAسازي
سيكل بعدي
1- 45-ثانيه 92ـ94 واسرشت كردن
2-50 ثانيه 50- 60 اتصال اغازگرها
1-3دقيقه 72 DNAسازي
سيكل آخر
1ـ45 ثانيه 92ـ 94 واسرشت كردن
2ـ50 ثانيه 50 –60 اتصال اغازگرها
3ـ4-10 دقيقه 72 DNA سازي
| Design By : Pars Skin |
